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              經典回顧|基于M22的TRAb檢測方法
              更新時間:2023-08-14   點擊次數:66次



              來自RSR FIRS 實驗室的 Sanders等發現[5],小鼠促甲狀腺激素單克隆抗體與促甲狀腺激素受體(TSHR)的結合,可以被促甲狀腺激素受體自身抗體(TRAb)所抑制。實驗室用放射性125I標記的人TSHR單克隆抗體(M22™)構建了一種分析方法[6]。


              本文我們描述了一種檢測TRAb的新方法,其中TRAb競爭抑制了促甲狀腺激素受體人單克隆抗體M22(生物素標記)與包被于酶聯免疫法(ELISA)微孔板上的TSHR的結合。同時我們將基于M22與基于TSH結合抑制的方法進行了比較。





              研究對象與方法




              檢測方法

              三代TRAb(RSR促甲狀腺激素受體抗體檢測試劑盒):基于M22與血清中TRAb競爭抑制的ELISA法。TRAb每次檢測均包括一套使用正?;旌涎?HBD pool)稀釋后的TSHR自身抗體國際標準物質NIBSC90/672。結果以每升M22-生物素結合的百分比抑制率為單位(1-[檢測血清的OD450/HBD的OD450])×100。


              二代TRAb(RSR促甲狀腺激素受體抗體檢測試劑盒):基于TSH與血清中TRAb競爭抑制的ELISA法。


              放免法:Southgate等人[7]所述,利用TRAb與125I標記的TSH間競爭結合可溶性豬TSHR的機制測定血清中TRAb含量(RSR試劑盒)。


              甲狀腺過氧化物酶(TPOAb)和甲狀腺球蛋白(TgAb)的自身抗體采用Beever等人[8]的直接測定法測定。TPOAb單位U/mL(NIBSC 66/387),測量范圍為1.5 - 500 U/mL;TgAb單位U/mL(NIBSC 65/093),測量范圍為3 - 1000 U/mL。


              結果


              標準物質90/672在三種不同的TSHR自身抗體檢測法中的劑量-效應關系見圖1。

              圖1 90/672對促甲狀腺激素受體(TSHR)與抗體結合抑制的影響。


              標準物質90/672 濃度為0.2 U/L時,對M22-生物素結合的抑制率約為10%;濃度為0.8 U/L時,對TSH-生物素結合的抑制率約為10%。在基于PEG的實驗中,125I標記的TSH結合抑制率約為10%時,標準物質濃度約為2 U/L。


              在相同結合抑制率(10%)的前提下,標準物質濃度由小到大依次為:M22-biotin,TSH-biotin,125I-TSH(PEG)。


              三代TRAb的批內檢測精密度:


              對一份正?;旌涎暹M行64次測量得到的平均值±標準差(SD)為0.041±0.04 U/L (450 nm處的平均吸光度=2.1±0.079),表明該檢測法的檢測下限(2倍SD)為0.12 U/L。


              三代TRAb的批間精密度如下(圖2):在0.3 U/L時為14%,在6 U/L時為6.5%。


              二代TRAb的批間CV值,在1 U/L時為20%,在4 U/L時為6%。


              圖2 不同患者血清間變異系數(CV)與TRAb濃度的關系圖。


              三代TRAb測定M22結合的抑制率如下:

              圖3 基于M22-生物素對TSHR結合的抑制,使用ELISA檢測不同患者組的自身抗體。MG,重癥肌無力;SLE,全身性紅斑狼瘡;RA,類風濕性關節炎;HBD,健康獻血者。



              在108例Graves組中三代TRAb與二代TRAb之間結合抑制率的相關系數r值為0.99,如圖4所示。


              圖4 比較M22-生物素對TSHR包被的ELISA板孔和TSH-生物素對TSHR包被的ELISA板孔的抑制作用,來自108名Graves病患者(治療和未治療)。如圖所示的線與每個軸呈45度角。通過圖上的點進行最佳擬合的直線(未顯示)的方程是y=1.084x-10.56,r=0.99。


              三代TRAb、二代TRAb和125I-TSH(放免法)檢測TRAb的受試者工作曲線(ROC)[9]見圖5。在此分析中,靈敏度數據來自108例Graves病組。特異性數據來自60例無臨床甲狀腺疾病證據的患者(和臨床工作人員)組。當特異性為100%時,三代TRAb、二代TRAb和放免法的靈敏度分別為95%、89%和62%。

              圖5 三種不同TSHR自身抗體檢測的靈敏度與100-特異性的關系圖。


              干擾性研究中,TSH (NIBSC 94/674)最高達3 U/L,人絨毛膜促性腺激素(hCG) (NIBSC 75/589)最高達160 U/mL,促卵泡激素FSH (NIBSC 92/640)最高達69 U/mL,促黃體生成素LH (NIBSC 80/552)最高達10 U/mL,對M22-生物素與TSHR的結合沒有影響(結合的最大抑制率為0%)。


              討論

              我們的結果表明,三代TRAb與二代TRAb及其類似方法相比,可以檢測出更低濃度的TRAb標準物質(NIBSC 90/672)。 三代TRAb的精密度優于二代TRAb產品。


              在108例Graves病組,幾乎所有的樣本用三代TRAb比二代TRAb有更好的競爭抑制效果。以二代檢測抑制率為20%為對照,只有1份血清樣本在基于M22檢測的三代檢測中具有明顯較弱的效果(14%抑制率)(圖4;結果經多次重復測定證實)。


              在307例對照組(包括臨床工作人員、健康獻血者和未診斷為Graves病的患者)中,只有2例(0.65%)對M22結合的抑制率大于10%。其中一例患者(三代TRAb抑制率11%)報告過度疲勞(無明確原因),另一例患者(三代TRAb抑制率12%)有原發性甲狀旁腺功能減退和自身免疫性甲狀腺功能減退。目前尚不清楚這些低檢測值(在反復試驗中得到證實)是試驗中非特異性干擾的結果,還是與低水平TRAb有關。但在二代TRAb和放免法中,兩例患者的血清均為TRAb陰性,但兩例患者的血清均含有TPO自身抗體(按先后順序分別為20 U/mL和70 U/mL)。


              在特異性方面,三代TRAb不受TPO自身抗體或Tg自身抗體的影響,在18例自身免疫性甲狀腺功能減退患者中的17例未觀察到抑制現象,17例患者中一些患者一種或兩種自身抗體水平較高(9/17例TPOAb水平大于500 U/mL,4/17例TgAb水平大于1000 U/mL)。同樣,乙酰膽堿受體、dsDNA和類風濕因子的自身抗體均不抑制M22的結合(圖3),進一步強調了該試驗的特異性。此外,高濃度的TSH(最高達3 U/L)、FSH(最高達69 U/mL)、LH(最高達10 U/mL)或hCG(最高達160 U/mL)對檢測沒有任何干擾。


              圖5所示的ROC圖顯示,在108例Graves病組中,有5例(4.6%)TRAb檢測為陰性。在這5例患者中,患者A因甲狀腺相關眼病接受甲狀腺素(T4) (有131I治療史)和糖皮質激素治療;患者B予卡比馬唑+T4治療5年;患者C卡比馬唑停藥9年,采血前甲狀腺功能正常;D患者接受T4治療(1976年用131I治療)?;颊逧在進行TRAb檢測時沒有臨床資料。二代TRAb測定A-E患者血清中TRAb均為陰性(均小于1 U/L,抑制率小于10%),放免法結果呈陰性或在灰區(TSH結合的抑制率為6% - 15%)。此外,5份血清中均未檢測到Tg自身抗體,1份血清中TPO自身抗體水平較低(2.5 U/mL)。我們無法在這5份血清中檢測到TRAb,這可能與5例患者中至少4例在臨床和生化特征,以及對TSHR缺乏主動免疫反應的原因有關。


              二代TRAb能檢測到96/108(89%)的Graves病血清,特異性為100%。二代ELISA結果陽性的樣本,在三代ELISA中均能檢測到。ROC曲線同時強調,相比于放免法,固相包被TSHR的ELISA方法更有優越性。在放免法中,100%的特異性情況下,108份Graves血清中只有67份(62%)被檢測到TRAb,其靈敏度明顯低于本文介紹的新TRAb測定方法。


              基于標記的TSHR單克隆抗體檢測TSHR自身抗體的方法已有報道[5,6]。然而,基于純化Graves患者IgG檢測TSHR自身抗體的方法早在幾十年前就有報道[10,11]。然而,在TSHR自身抗體檢測中,與親和純化的患者血清自身抗體作為配體相比,人或動物TSHR單克隆抗體確實具有相當大的優勢,例如這類單抗容易生產為大批量、質地均勻、純凈且穩定的制劑。單克隆抗體也相對容易操作(例如,通過片段化或突變),以獲得適合特定測定系統的制劑。


              三代TRAb與二代TRAb間檢測Graves病血清TRAb結果密切相關(r=0.99)。此外,來自FIRS 實驗室的Sanders等人也觀察到一系列Graves病患者血清在抑制小鼠促甲狀腺激素受體單克隆抗體對TSHR的結合抑制,以及患者血清對標記TSH和TSHR之間的結合抑制間的密切關系[5]。此外,無論自身抗體是常見的刺激型還是少見的阻斷型,對受體的結合效果似乎效果接近[5,6,13]。這些早期的研究和目前的報道都強調了患者血清中TSHR自身抗體(無論刺激型或阻斷型)、TSH和促甲狀腺單克隆抗體(包括M22™)在TSHR上的結合位點之間的密切關系。然而,研究結果與有關TSHR不同區域參與TSHR自身抗體與TSH激動劑和TSH拮抗劑特性結合的報道不一致[14-16]。


              總之,我們所描述的基于M22-生物素的TRAb的最新第三代檢測方法比起早期檢測方法有相當大的優勢,在檢測低水平自身抗體方面是非??煽康?。尤其需要評估低水平TSHR自身抗體檢測,三代TRAb在早期輕度Graves病患者和有Graves病眼部體征但無甲亢史的患者中具有應用價值。

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              參考文獻 Smith B R ,  Bolton J ,  Young S , et al. A New Assay for Thyrotropin Receptor Autoantibodies[J]. Thyroid, 2004, 14(10):830-835.





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